Эпифитная микрофлора. На поверхностных частях растений постоянно присутствует разнообразная микрофлора, называемая эпифитной. На стеблях, листьях, цветах, плодах наиболее часто встречаются следующие неспоровые виды микроорганизмов: Erwinia herbicola составляет 40 % всей эпифитной микрофлоры, Pseudomonas fluorescens - 40 %, молочнокислые бактерии - 10 %, им подобные - 2 %, дрожжи, плесневые грибы, целлюлозные, маслянокислые, термофильные бактерии - 8 %.

После скашивания растений и потери ими сопротивляемости, а также в силу механического повреждения их тканей эпифитная и прежде всего гнилостная микрофлора, интенсивно размножаясь, проникает в толщу растительных тканей и вызывает их разложение. Именно поэтому продукцию растениеводства (зерно, грубые и сочные корма) предохраняют от разрушительного действия эпифитной микрофлоры консервированием различными методами.

Известно, что в растениях имеется связанная вода, входящая в состав их химических веществ, и свободная - капельно-жидкая. Микроорганизмы могут размножаться в растительной массе только при наличии в ней свободной воды. Одним из наиболее распространенных и доступных методов удаления из продуктов растениеводства свободной воды и, следовательно, их консервирования является высушивание и силосование.

Сушка зерна и сена предусматривает удаление из них свободной воды. Поэтому микроорганизмы на них размножаться не могут до тех пор, пока эти продукты будут сухими. В свежескошенной неперестоявшей траве воды содержится 70...80 %, в высушенном сене только 12... 16 %, оставшаяся влага находится в связанном с органическими веществами состоянии и микроорганизмами не используется.

Во время сушки сена теряется около 10 % органических веществ, главным образом за счет разложения белков и сахаров. Особенно большие потери питательных веществ, витаминов и минеральных соединений отмечаются в высушенном сене, находящемся в прокосах (валках), когда часто идут дожди. Дождевая дистиллированная вода вымывает их до 50 %.

Значительные потери сухого вещества происходят в зерне при его самонагревании. Этот процесс обусловлен термогенезом, т. е. созданием тепла микроорганизмами. Возникает он потому, что термофильные бактерии в процессе своей жизнедеятельности используют только 5... 10 % энергии потребляемых ими питательных веществ, а остальная выделяется в окружающую их среду - зерно, сено.

Микрофлора силоса. При выращивании кормовых культур (кукурузы, сорго и др.) с одного гектара удается получить в зеленой массе значительно больше кормовых единиц, чем в зерне. По крахмальному эквиваленту питательность зеленой массы при сушке может снизиться на 50 %, а при силосовании - только на 20 %. При силосовании не теряются мелкие листья растений, обладающие высокой питательностью, а при высушивании они опадают.

Закладку силоса можно производить и при переменной погоде. Хороший силос представляет собой сочный, витаминный, молокогонный корм.

Микроорганизмы почвы попадают на поверхность наземной части растений и формируют эпифитную микрофлору, количественные и видовые характеристики которой зависят от вида растения. В состав эпифитной микрофлоры всегда входят лактобактерии, играющие важную роль в силосовании растений. Под действием ферментов - возбудителей молочнокислого и уксуснокислого брожения - происходит сбраживание сахаров корма до молочной и уксусной кислот, которые оказывают ингибирующее действие на ферментные системы микроорганизмов других групп, в том числе и гнилостных. Чистые культуры Lactococcus planta-rum , Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus вносят в силосную массу для накопления антибиотических и стимулирующих организм животных веществ. Ризосферная и эпи-фитная микрофлора могут играть и негативную роль. Корнеплоды нередко поражаются гнилью (черной - Aitemaria radicina, серой - Botrutus cinirea, картофельной - Phitophtora infenstans). К порче силоса приводит чрезмерная деятельность возбудителей маслянокислого брожения. На вегетирующих растениях размножается спорынья (Claviceps purpurne), вызывающая заболевание эрготизм. Грибы вызывают токсикозы. Возбудитель ботулизма (Clostridium botulinum), попадая в корм с почвой и фекалиями, служат причиной тяжелого токсикоза, нередко с летальным исходом. Многие грибы (Aspergillus, P?nicillium, Mucor, Fusarium, Stachybotrys) заселяют корма, размножаясь при благоприятных условиях, и вызывают у животных острые или хронические токсикозы, чаще проявляющиеся неспецифическими симптомами.

Сущность силосования состоит в том, что в заложенной в емкости измельченной зеленой массе интенсивно размножаются молочнокислые микробы, разлагающие сахара с образованием молочной кислоты, накапливающейся в количестве до 1,5...2,5% к массе силоса. Одновременно размножаются уксуснокислые бактерии, превращающие спирт и другие углеводы в уксусную кислоту; ее накапливается 0,4...0,6 % к массе силоса. Молочная и уксусная кислоты являются сильным ядом для гнилостных микробов, поэтому размножение их прекращается.

Силос сохраняется в хорошем состоянии до трех лет, пока в нем содержится не менее 2 % молочной и уксусной кислот, а pH составляет 4,0...4,2. Если размножение молочнокислых и уксуснокислых бактерий ослабевает, то концентрация кислот снижается. В это время одновременно начинают размножаться дрожжи, плесени, маслянокислые и гнилостные бактерии, и силос портится.

Таким образом, получение хорошего силоса зависит прежде всего от наличия в зеленой массе сахароз и интенсивности развития молочнокислых бактерий.

• Вперые описаны как виды Streptococcus. - Примеч. рвд.

Эпифитная микрофлора. Микрофлору, находящуюся на поверхности растений, называют эпифитной (поверхностной). Как правило, эта травяная палочка Bact.herbicola, занимающая около 40 % всей эпифитной микрофлоры, молочнокислые стрептококки и палочки, сенная и картофельная бациллы, флюоресцирующие бактерии, протей, сарцины, актиномицеты, плесени, дрожжи и др.

Эпифитная микрофлора представлена главным образом безвредными сапрофитами, однако при скашивании растений они могут интенсивно размножаться, вызывая гнилостные и бродильные процессы, приводящие к порче и разложению корма. Для предотвращения этих процессов растительные корма консервируют. Наиболее эффективным способом консервирования скошенной травы, зерна и других кормов является сушка. Сено сушат в прокосах, валках, копнах, на вешалах с помощью принудительной вентиляции атмосферным или подогретым воздухом. При этом, однако, следует иметь в виду, что пересушивание зеленой массы приводит к потере питательных веществ, особенно протеина и каротина. При увлажнении высушенного корма в нем вновь возникают микробиологические процессы, приводящие к повышению температуры, т. е. происходит термогенез (самонагревание) за счет деятельности вначале мезофильной, а затем термофильной микрофлоры. При умеренном развитии самонагревания солома, например, становится самопрелой и лучше поедается скотом. Явление микробного термогенеза в районах с влажным климатом используют для приготовления так называемого бурого сена.

Силосование (заквашивание) кормов. Это лучший способ консервирования зеленого корма, при котором растительную массу укладывают в силосные ямы, траншеи, башни и другие сооружения. Для понимания сущности процессов, происходящих при силосовании, необходимо детально знать биохимию и микробиологию его.

Существует два способа силосования: холодный и горячий. При холодном способе, имеющем наибольшее распространение, в созревающем силосе происходит умеренное повышение температуры — до 25— 30 °С. Растительная масса в этом случае укладывается в траншею одномоментно, утрамбовывается и изолируется слоем земли.

При горячем способе силосная траншея заполняется по частям, без утрамбовки, с перерывами в 1—2 дня. При таком силосовании обеспечивается аэробиоз, более интенсивно идут микробиологические и ферментативные процессы, в результате которых температура корма повышается до 45—50 °С. Затем укладывают второй слой толщиной до 1,5 м, третий, и так до полного заполнения траншеи. Горячий способ силосования применяется реже, поскольку разогревание растительной массы приводит к потере питательных веществ. Его целесообразно использовать для силосования грубо-стебельчатых кормов из малоценных трав, а также соломы.

В процессе созревания зеленой массы при холодном силосовании различают три последовательные фазы:

первая фаза (развития смешанной микрофлоры) связана с бурным размножением эпифитной микрофлоры, кишечной палочки, псевдомонаса, дрожжей, молочнокислых и гнилостных бактерий. Длительность первой фазы — 1—3 дня. В это время силос разогревается и подкисляется, создаются анаэробные условия, в результате чего большая часть смешанной микрофлоры погибает;

вторая фаза характеризуется вначале бурным размножением молочнокислых стрептококков, а затем молочнокислых палочек, продуцирующих молочную кислоту, которая подавляет размножение гнилостных и маслянокислых микроорганизмов, кроме споро-образующих. Длительность второй фазы от 2 нед до 3 мес;

третья фаза (конечная) связана с постепенным отмиранием в созревающем силосе возбудителей молочнокислого брожения (Sir. lactis, Str. plantarum, Str.thermophilus), концентрация молочной кислоты достигает 60 % и более, рН силосной массы снижается до 4,2—4,5. Кроме молочной кислоты в силосе накапливаются уксусная и даже масляная кислоты. Концентрация уксусной кислоты не должна превышать 40—60 % всех органических кислот, масляной кислоты должно быть не более 0,2 %.

При несоблюдении технологии приготовления силоса и его хранения он может заплесневеть, прогоркнуть и перекиснуть. Для профилактики пороков силоса микробного происхождения используют бактериальные закваски молочнокислых бактерий (Lactobacillus plantarum, Str. lactis diastaticus), пропионово-кислых и других бактерий. Кроме того, используют буферные кислотные смеси, содержащие разные минеральные кислоты, а также препараты, содержащие формиат кальция, метабисульфит, пиросульфит натрия, сульфаминовую, бензойную, муравьиную кислоты и другие вещества.

Дрожжевание кормов. Для обогащения кормов белком и витаминами используют кормовые или пивные дрожжи. Дрожжевание производят заквасочным или опарным методом. (Технология их дана в специальной литературе.)

Сенаж. Изложенные выше сведения относятся к консервированию кормов, имеющих нормальную влажность (около 75 %). Если влажность консервируемой массы значительно ниже (50— 65 %), то происходит хорошая ферментация даже при дефиците углеводов и получается корм высокого качества — сенаж. При этом рН корма может быть довольно высоким — около 5, так как гнилостные бактерии обладают меньшим осмотическим давлением, чем молочнокислые. При подсушивании корма в нем приостанавливаются гнилостные процессы, но продолжают действовать возбудители молочнокислого брожения. На этом основано приготовление сенажа, когда несколько подсушенную массу закладывают для консервирования, как при холодном силосовании.

Исследованиями авторов было показано, что в клевере, влажность которого составляла 50 % и ниже, развиваются микробиологические процессы. Они протекают тем слабее, чем суше корм. Доминирующей микрофлорой в консервируемом корме очень быстро становятся молочнокислые бактерии. Эта группа довольно специфичных микроорганизмов близка к Lactobacillus plantarum, но отличается способностью расти в условиях значительно более сухой среды и сбраживать крахмал. Их развитие в корме приводит к накоплению в нем некоторого количества молочной и уксусной кислот.

По типу сенажирования хорошо сохраняются предназначенные на корм измельченные початки кукурузы с влажностью 26—50 % (оптимум 30—40 %). В последнее время рекомендуют обрабатывать недосушенное сено (влажностью около 35 %) жидким аммиаком, который действует как консервант. При введении аммиака в корме создается щелочная реакция, блокирующая микробиологические и ферментативные процессы. Обработанный аммиаком корм должен быть покрыт каким-либо изоляционным материалом (Е. Н. Мишустин, В. Т. Емцев, 1987).

Корма определяют состояние и продуктивность животных. По происхождению различают растительные, животные и минеральные корма. Растительные корма занимают наибольший удельный вес. В зависимости от содержания влаги в заготовленных растительных кормах различают: сено (12-17%), сенаж (40-50%), силос (70-80%).

Эпифитная микрофлора. Микробиологические процессы, происходящие при силосовании кормов

Микроорганизмы, которые живут и размножаются на наземных частях растений, называют эпифитными. Изучение видового состава микробов, необходимо, чтобы знать какие процессы они могут вызвать при заготовке и хранении кормов. Количество микробов на растениях зависит от фазы развития растения, влажности, температуры и др.факторов. при увлажнении численность микроорганизмов возрастает. Чем старше растение, тем больше микробов. На поверхности листьев растений содержится большое количество аммонификаторов и меньше других - молочнокислых, маслянокислых, дрожжей, эшерихий.

Для эпифитов характерно то, что они, находясь на поверхности растений, хорошо переносят действие фитонцидов, солнечных лучей и питаются веществами, выделяемыми растениями. Устойчивость эпифитов к фитонцидам гораздо выше, чем у почвенных микробов. Вместе с тем рост микробов на поверхности растений ограничен, так как они выделяют незначительное количество питательных веществ. Эпифиты не повреждают и не проникают в ткани здорового растения. Велика роль в этом естественного иммунитета и цидных веществ. (растения выделяют фитонциды)

При изучении эпифитной микрофлоры строгой специфичности к определенным растениям не выявлено.

После скашивания растений, микробы начинают активно размножаться так как исчезают преграды, препятствующие проникновению микробов в их ткани. Происходит потеря питательных веществ и порча корма. Он приобретает гнилостный, затхлый запах, изменяет окраску. Растения легко разрываются, их консистенция становится мажущейся. Такой корм плохо поедается животными и представляет опасность для их здоровья.

ЭПИФИТНАЯ МИКРОФЛОРА ЗЕРНА И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ ПРИ ХРАНЕНИИ КОРМА
На поверхности зерна обитает разнообразная микрофлора. Часть микроорганизмов попадает из ризосферы, часть заносится с пылью и насекомыми. Однако на зерне, как и на всей поверхности растений, развиваются лишь некоторые микроорганизмы так называемые эпифиты. Эпифитные микроорганизмы, размножающиеся на поверхности стеблей, листьев и семян растений, получили название микроорганизмов филло-с ф е р ы. Эпифиты питаются продуктами экзосмоса растений. Условия жизни эпифитных бактерий своеобразны. Они довольствуются небольшими запасами питательных веществ на поверхности растений, устойчивы к высоким концентрациям фитонцидов, выдерживают периодические колебания влажности. Поэтому численность их невелика и видовой состав довольно постоянный. Более 90% эпифитных микроорганизмов составляют гнилостные бактерии. В основном эпифит- ная микрофлора представлена неспороносными бактериями. Большую часть бактериального населения зерна составляют неспороносные палочки рода Pseudomonas.активно развивающиеся на поверхности растений. Особенно часто встречается Pseudomonas herbicola (Erwinia herbicola),образующая на плотных средах золотисто-желтые колонии. Встречаются также Pseudomonas fluorescens,микрококки, молочнокислые бактерии, дрожжи. Бациллы и микроскопические грибы составляют небольшой процент.
В определенных условиях эпифитные микроорганизмы могут быть полезны для растений, так как препятствуют проникновению паразитов в ткани растения.
При хранении зерна эпифитные микроорганизмы могут играть отрицательную роль. В зрелом зерне вода находится в связанном состоянии и недоступна микро-организмам. На таком зерне они находятся в состоянии анабиоза (покоя). На развитие микроорганизмов на зерне, а следовательно, на сохранность последнего решающее влияние оказывают: влажность, температура, степень аэрации, целостность зерна и состояние его покровных тканей. На зерне с повышенной влажностью микроорганизмы размножаются тем быстрее, чем выше температура.
Развитие микробиологических процессов в хранящемся зерне с повышенной влажностью приводит к заметному, а иногда и к очень значительному повышению температуры. Это явление получило название термогенеза.
Самосогревание зерна ведет к смене микрофлоры. Свойственная зерну эпифитная микрофлора исчезает. Сначала обильно размножаются непигментированные неспороносные палочки, вытесняющие Erwinia herbicola.Позднее появляются термостойкие (термотолерантные) микрококки, образующие на плотных средах чаще всего мелкие белые плоские колонии, плесневые грибы, актнномицеты. Дальнейшее развитие процесса самосогревания (свыше 40-50°С) способствует развитию спорообразующих и термофильных бактерий.
По мере самосогревания изменяется и видовой состав плесневых грибов. Виды Penicillium,которые преоб-ладали вначале, заменяются видами Aspergillus.
Таким образом, по видовому составу микрофлоры можно судить не только о том, подвергалось ли зерно самосогреванию, но и насколько далеко зашел этот процесс. Преобладание Ertioinia herbicolaв микробном ценозе зерна служит показателем его хороших качеств. Большое количество спорообразующих бактерий и грибов указывает на потерю всхожести семян.
Благоприятные условия для развития на зерне микроорганизмов приводят к накапливанию выделяемых ими токсинов. В результате при сщрмливашш такого зерна скоту и домашней птице часто возникают кормовые отравления.
Таким образом, правильное хранение зерна должно сводиться к тому, чтобы не допускать развития на нем микроорганизмов.
Для количественного учета микроорганизмов на зерне навеску массой 5 г помещают в колбу с 50 мл стерильной водопроводной воды и 2-3 г песка. Колбу взбалтывают круговыми вращательными движениями в течение 10 мин. Из полученной.вытяжки готовят последующие разведения (10~2; 10_3; 10-4). Отдельными стерильными пипетками Мора берут по 10 мл суспензии и переносят в колбы, содержащие по 90 мл стерильной водопроводной воды. Затем из каждой колбы берут по 1 мл суспензии соответствующего разведения в стерильные чашки Петри в двух повторностях. В каждую чашку Петри выливают по 1 пробирке расплавленного, но предварительно охлажденного до 50°С МПА. Чашки инкубируют при температуре 30° С. Наряду с МПА используют элективные среды, описанные в разделе «Анализ силоса».
Через 3-5 дней инкубации подсчитывают общее число колоний, выросших на МПА в чашках, и рассчитывают количество микроорганизмов на 1 г зерна.
Для определения качественного состава микрофлоры зерна колонии группируют по культуральным признакам, из каждой группы колоний готовят препараты, выявляют принадлежность микроорганизмов к роду или семейству и определяют численность бактерий каждой группы в процентах от общего количества микроорганизмов.
Для идентификации выделенные культуры микроорганизмов очищают.
На основании микробиологического анализа, дела-ют заключение о качестве зерна.
На свежем доброкачественном зерне преобладает Erwinia herbicola(до 80%), образующая блестящие оранжевые колонии. Встречаются Pseudomonas fluores- cens,формирующая желтовато-зеленоватые флуоресцирующие колонии, непигментированные неспорообразую-щие палочки, дрожжи (колонии блестящие, выпуклые, часто окрашенные в розовые тона). При учете на сусло- агаре с мелом выявляются молочнокислые бактерии, образующие чечевицеобразные мелкие колонии с зонами растворения мела.
На несвежем зерне, хранившемся в условиях повышенной влажности, Erwinia herbicola, Pseudomas fluo- rescensне выявляются. Обнаруживаются микрококки, образующие мелкие белые блестящие плоские колонии, спорообразующие палочки, актиномицеты, а также неспороносные палочки. При учете на сусло-агаре выявляется значительное количество грибов, главным образом относящихся к роду Penicillium,а также Aspergillus.
Материалы и оборудование. Зерно в колбах свежее и несвежее, хранившееся в условиях повышенной влажности. Весы и разновесы. Часовые стекла. Колбы со стерильной водой (по 90 мл), колбы со стерильной водой (по 50 мл) и песком. Стерильные пипеткн Мора на 10 мл и на 1 мл. Стерильные чашки Петри. МПА в пробирках и колбах. Водяная баня, треножник. Микроскопы и все необходимое для микроскопирсвания.
АНАЛИЗ СИЛОСА
Молочнокислые бактерии, обитающие на растениях, играют большую роль при силосовании кормов. В основе силосования лежит молочнокислое брожение. Молочнокислые бактерии сбраживают сахара силосующихся растений в молочную и частично уксусную кислоту, которые подавляют развитие гнилостных, маслянокислых и других нежелательных бактерий, портящих корм. Молочнокислые бактерии снижают pH корма до 4,2-
Если кислотность силоса по тем или иным причинам уменьшается (pH становится выше 4,5-4,7), то создаются условия, благоприятствующие жизнедеятельности вредных для сохранности кЬрма микроорганизмов.
В нем накапливаются дурно пахнущая масляная кислота, амины, аммиак и другие продукты.
Для того чтобы обеспечить нормальное развитие молочнокислых бактерий в процессе силосования, необ-ходимо достаточное содержание сахара в силосующихся растениях и изоляция корма от доступа воздуха, т. е. создание анаэробных условий.
Плесневые грибы переносят сильное подкисление, но являются строгими аэробами, поэтому в хорошо спрессованном, укрытом, заквашенном корме размножаться не могут.
Если проследить за распадом сахара и образованием органических кислот в процессе силосования, то можно заметить, что с уменьшением сахара увеличивается количество органических кислот. Однако снижение pH зависит не только от количества молочной и уксусной кислот, но и от буферности растительного материала, которая, в свою очередь, зависит от белка, солей. Чем больше буферность растительной массы, тем больше нужно кислот, чтобы снизить pH корма, т. е. более буферный материал связывает, нейтрализует часть молочной кислоты (ионы водорода). Поэтому, несмотря на накопление кислоты, pH среды почти ие снижается до тех пор, пока не израсходован весь материал, обеспечивающий буферность. Связанные буферным материалом кислоты образуют в силосе-запас так называемых связанных кислот. Более буферное исходное сырье для получения силоса хорошего качества должно иметь больше сахаров, чем менее буферное. Таким образом, силосуемость растений определяется также специфическими буферными свойствами.
Буферность растительной массы определяют титро-" ванием растертой растительной массы 0,1 н. раствором молочной кислоты до pH 4,0. Выясняют, сколько потре-буется молочной кислоты для смещения pH до 4,0. Поскольку для образования молочной кислоты затрачивается примерно 60% сахаров корма, то, рассчитав 100%, определяют так называемый сахарный минимум для данного растительного сырья, т. е. наименьшее количество сахара, необходимое для образования такого количества молочной и уксусной кислот, чтобы сместить pHДо 4,0.
Растения хорошо силосуются, если в них много са-хара, а сахарный минимум небольшой. Если фактичес-
кое содержание сахара в растениях примерно равняет і ся сахарному минимуму, то они силосуются плохо и малейшее оФклонение в процессе силосования приведет к порче силоса. Если фактическое содержание сахара меньше- сахарного минимума, то такие растения ие силосуются.
При силосовании сохраняются цветки и листья, содержащие наибольшее количество питательных веществ. Потери сухих веществ при правильном силосовании не превышают 10-15%. Хороший силос характеризуется следующими показателями: цвет - оливково-зеленый
(лишь несколько изменяется), запах - приятный (моченых яблок, печеного хлеба), pH 4-4,2, общая кислотность 2-2,5% (в переводе на молочную кислоту), влажность- 70%. Микрофлора хорошего силоса представлена молочнокислыми палочками и молочнокислыми стрептококками, часто в небольших количествах встречаются дрожжи. Последние образуют эфиры, придающие силосу приятный запах и обогащающие корм белком и витаминами. Однако в больших количествах дрожжи ухудшают качество силоса - они снижают его кислотность, так как являются конкурентами с молочнокислыми бактериями в потреблении сахара.
В первый период после закладки силоса бурно развивается микрофлора смешанной фазы брожения, обычно представленная на поверхности здоровых растений: гнилостные бактерии (в основном неспорообразующие палочки), бактерии группы кишечной палочки, маслянокислые бактерии и др. При подкисЛении корма их сменяют молочнокислые стрептококки, а затем более кислотоустойчивые молочнокислые палочки. Через две недели (при снижении pH до 4,0 и ниже) микробиологические процессы в силосе в основном заканчиваются.
Для анализа из торцовой части траншеи, ям или наземных буртов берут среднюю пробу силоса. Для этого, сняв стерильным ножом верхний слой, вырезают кубики по средней линии бурта, с интервалом в 1 м. Их складывают в стерильную стеклянную банку емкостью 1-2 л с притертой пробкой так, чтобы силос был уложен плотно и доверху. Пробы перемешивают в стерильном кристаллизаторе, измельчают стерильными ножницами и берут навески для анализов.
Исследование рекомендуется проводить не позднее суток после взятия пробы.
Микроскопическое исследование микрофлоры силоса
Для знакомства с микрофлорой силоса из него гото> вят препарат следующим образом. Берут пинцетом силос и плотно прижимают его к предметному стеклу без добавления воды, стараясь, чтобы на стекле остался отпечаток. Препарат сушат на воздухе, фиксируют на пламени и окрашивают метиленовым синим (2-3 мин). Смыв краситель водопроводной водой и высушив вдали от пламени, микроскопируют с иммерсионной системой.
На препарате выявляются тонкие неспорообразующие палочки, варьирующие в размере (молочнокислые бактерии) и молочнокислые стрептококки. Среди них обычно преобладают Lactobacterium plantarum- го- моферментативные мезофильные" короткие палочки, часто располагающиеся параллельными рядами. Иногда встречаются клетки почкующихся дрожжей. Споровые формы бактерий наблюдаются редко. В плохом силосе выявляются спорообразующие палочки (маслянокислые бактерии, аэробные гнилостные бактерии), а также плесневые грибы.
Количественный учет микроорганизмов в силосе
Навеску силоса 5 г помещают в колбу с 50 мл стерильной водопроводной воды и 2-3 г песка. Колбу взбалтывают круговыми вращательными движениями в течение 10 мин. Из полученной вытяжки готовят последующие разведения (10-2; 10+ 10+ 10+ 10~6), а затем высевают из соответствующих разведений на элективные среды по 1 мл суспензии при глубинном посеве, по 0,05 мл суспензии при поверхностном посеве. Посевы выдерживают при температуре 28°С.
Определение количества молочнокислых бактерий проводят на сусло-агаре с мелом или капустном агаре с мелом (среды 1, 1а), а также на капустном агаре со спиртом и мелом (среда 2) - глубинный посев. Вокруг колоний молочнокислых бактерий вследствие накопления молочной кислоты образуются зоны растворения мела (рис. 37).
Подсчет колоний молочнокислых бактерий на сусло- агаре с мелом и капустном агаре с мелом проводят на
6-й день, а на капустном "агаре со спиртом и мелом- на 7-10-й день. Среда 2 необходима для выявления молочнокислых бактерий в составе эпифитной микрофлоры исходной растительной массы, так как спирт тормозит рост посторонней микрофлоры. Количество посторонней микрофлоры (аэробных гнилостных микроорганизмов) определяют глубинным посевом на пеп- тонном агаре (среда 3). Подсчет колоний ведется на 5-

Рис. 37. Зоны растворения мела вокруг колоний молочнокислых бактерий силоса.
7-й день.
Количество микроскопических грибов и дрожжей определяется на сусло-агаре со стрептомицином (среда 4) поверхностным посевом. Подсчет колоний ведется на 3-4-й день (при необходимости повторно на 7-8-й день).
Титр маслянокислых бактерий устанавливают на жидкой среде Емцева (среда 5а) и картофельной среде (среда 5). Для определения количества спор мясляно- кислых бактерий ведется посев из суспензии, после пастеризации в течение 10 мин при 75°С. Учет результатов анализа ведется по интенсивности выделения газа (кусочки картофеля всплывают на поверхность жидкости), и титр маслянокислых бактерий и их спор устанавливают методом предельных разведений по Мак- Креди.
Аэробные протеолитические бактерии учитывают на мясо-пептонном бульоне (среда 6) по накоплению газа в поплавках. Посевы выдерживают при 28°С в течение двух недель.
При анализе силосов из трав, выращенных по фону высоких доз азотных удобрений, проводится также учет денитрифицирующих бактерий на среде Гильтая (среда 7). Посевы выдерживают в течение 10-12 дней при 28°С. Подсчет денитрификаторов ведется по интенсивности выделения газа и изменению цвета индикатора.
При анализе силоса ведется также учет спор аэробных гнилостных бацилл. На плотной среде (среда 8)
делают поверхностный посев. Чашки инкубируют при 28°С, подсчет колоний проводят на 4-й день.
Бактерии группы кишечной палочки учитывают на среде Кесслера или Булира по выделению газа и накоплению его в поплавках. Пробирки выдерживают 48 ч при 40-42°С.
Состав элективных сред
Среда 1. Сусло-агар с мелом. Сусло, разбавленное до 3% по Еаллингу,- 1 л, агар - 20-25 г, стерильный мел - 30 г. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин.
Среда 1а. Капустный агар с мелом. Капустный бульон - 900 мл, дрожжевой экстракт-100 мл, пептон-10 г, глюкоза - 20 г, ацетат натрия - 3,35 г, марганец сернокислый - 0,025 г, агар - 15-20 г.
Стерильный мел добавляют в колбы из расчета 5 г на 200 мл среды. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин.
Среда 2. Капустный агар со спиртом и мелом. В расплавленную н охлажденную до 50° С среду прибавляют 20 мл этилового спирта (96%-ного) на 200 мл среды, тщательно взбалтывают и заливают в чашки Петри с посевным материалом.
Среда 3. Пептонный агар. . Пептон - 5 г, К2НРО4 - 1 г, . КН2РО4 - 0,5 г, MgSOi - 0,5 г, NaCl - следы, водопроводная вода - 1 л, агар, хорошо промытый, - 15-20 г. Стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.
Среда 4. Сусло-агар со стрептомицином. Сусло, разбавленное до 3% по Баллингу,- 1 л, агар - 25 г. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Перед разливкой среды в чашки Петри в сусло-агао добавляют 80-100 ед. стрептомицина на каждый миллилитр среды.
Среда 4а. Подкисленный сусло-агар. Сусло, разбавленное до 3% по Баллингу,- 1 л, агар - 20-25 г. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Перед разливом среды в чашки Петри в расплавленный сусло-агар добавляют 2 мл молочной кислоты (на 1 л среды), прокипяченной в течение 10 мин иа водяной бане.
Среда 5. Картофельная среда с мелом. В пробирки вносят стерильный мел (на кончике скальпеля), 8-10 картофельных кубиков величиной 2-3 мм заливают водопроводной водой до s/4объема- пробирок. Стерилизуют при 1 атм в течение 30 мин.
Среда 5а. Картофельный крахмал - 20 г, пептон - 5 г, дрожжевой автолизат - 0,2 мг/л, КН2Р04- 0,5 г, К2НРО4 - 0,5 г, MgSC>4- 0,5 г, NaCl - 0,5 г, FeS04- 0,01 г, MnS04- 0;01 г, СаС03- 10 г, смесь микроэлементов no М. В. Федорову-1 мл, дистиллированная вода--1 л, тногликолевая кислота - 0,05%, нейтральрот - 0,004%) pH 7,4-7,5. Стерилизация среды осуществляется при- 0,5 атм в течение 30 мин. Температура инкубации посевов 30-35° С.
Среда 6. Мясо-пептонный бульон. Пептон - 10 г, NaCl - 4 г, мясной бульон - 1л. Наливают в пробирки с поплавками до 3/« объема. Стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.
Среда 7. Среда Гильтая (видоизмененная). Лимоннокислый нат-рий-2 г, KNO3- 1 г, КН2Р04- 1 г, К2НР04- 1 г, MgS04 -
1 г, СаС12 - 0,2 г, FeCl3- следы, дистиллированная вода - 1 л,
1 %-йьгй раствор бромтимолблау (pH 6,8-7,0). Стерилизуют прн 1 атм в течение 20 мин.
Среда 8. Мясо-пептонный агар и сусло-агар 1: 1. Стерилизуют при. 0,5 атм в течение 30 мин.
Среда 9. Среда Кесслера. К 1 л водопроводной воды прибавляют 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Смесь кипятят 15 мин на водяной баие, взбалтывают. Когда пептои растворится, фильтруют через вату, затем прибавляют 10 г лактозы. После растворения лактозы устанавливают слабощелочную реакцию (pH 7,6) и добавляют 4 мл 1%-ного водного раствора генциана фиолетового из расчета 1 г сухой краски на 25 л среды. Жидкость разливают в пробирки с поплавками"и стерилизуют при 1 атм в течение 15 мии.
Среда 10. Среда Булира. Кіл мясо-пептонного бульона добавляют 12,5 г маннита и 6 мл 1%-ного раствора нейтральрота. Среду разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Среда имеет вишневый цвет, при развитии кишечной палочки становится оранжевой и в поплавке скапливается газ.
Доминирующие на плотных средах колонии микроскопируют. Для обнаружения маслянокислых бактерий из пробирок с картофелем готовят препарат в раздавленной капле с добавлением раствора Люголя.
Определение кислотности
Определение общей кислотности в силосе. Берут навеску силоса 20 г и помещают в коническую колбу с обратным холодильником емкостью 500 мл. Содержимое колбы заливают 200 мл дистиллированной воды, тща-тельно перемешивают и нагревают в течение 1 ч. После охлаждения содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр и 10 мл фильтрата (с двойным количеством дистиллированной воды) оттитровывают 0,1 н. раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина до появления устойчивой слабо-розовой окраски.
Общее содержание кислоты в силосе в переводе на молочную выражают в процентах. 1 мл 0,1 н. раствора NaOH соответствует 0,009 г молочной кислоты. Умножив количество 0,1 н. NaOH, израсходованного на титрование экстракта из 100-г силоса, на 0,009, находят количество кислоты в силосе(%).
Пример расчета. На титрование 10 мл вытяжки израсходовано 1,7 мл 0,1 н. NaOH, следовательно, на 200 мл пойдет 34 мл 0,1 н. NaOH.
200 мл вытяжки получены из 20 г силоса, а для нейтрализации 100 г силоса будет израсходовано X мл 0,1 н. NaOH:
100.34
Х= --¦ =170 мл 0,1 и. NaOH.
Умножив 170 на 0,009, получим содержание молочной кислоты в процентах:
170 X0,009=1,53%
Достаточно точные результаты получаются и в том случае, если определение кислотности ведут следующим образом. Берут навеску силоса 5 г, растирают в ступке и помещают в широкую пробирку (диаметром 2-
см). Содержимое заливают 50 мл дистиллированной воды, закрывают резиновой пробкой и тщательно перемешивают. Навеску силоса настаивают при 10-12°С в:‘ течение 30 мин, а затем определяют кислотность вытяжки титрованием. 10 мл вытяжки (с двойным количеством дистиллированной воды) оттитровывают 0,1 и. раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина до появления устойчивой слабо-розовой окраски.
Пример расчета. На титрование 10 мл вытяжки израсходовано 1,7 мл 0,1 н. NaOH, следовательно, на 50 мл вытяжки-
мл; 50 мл вытяжки получены из 5 г силоса, а для нейтрализации 100 г силоса будет израсходовано X мл 0,1 н. NaOH:
100.8,5
Х=L = 170 мл 0,1 н. NaOH;
5
170 X0,009 = 1,53% молочной кислоты.
Определение pH в силосе. Приготовление вытяжки силоса для определения в нем pH проводят так же, как для определения общей кислотности в силосе. pH нахо-дят с помощью индикаторов или электрометрического определения. При использовании индикаторов поступают следующим образом. В фарфоровую чашку берут 2 мл вытяжки силоса и добавляют 2 капли индикатора (смесь равных объемов бромтимолблау и метилрота). Сравнивая цвет содержимого чашки с данными, приведенными ниже, определяют концентрацию водородных ионов. Цвет индикатора pH Красный 4,2 и ниже Красно-оранжевый 4,2-4,6 Оранжевый 4,6-5,2 Желтый 5,2-6,1 Желто-зеленый 6,1-6,4 Зеленый 6,4-7,2 Зелено-синий 7,2-7,6 Материалы и оборудование. Весы и разновесы, конические колбы емкостью 500 мл с обратным холодильником, широкие пробирки, треножник с асбестовыми сетками, колбы емкостью 100 мл и 250 мл, воронки, бумажные фильтры, пипетки на 10 мл и 2 мл, фарфоровые чашки, пинцеты; индикаторы: смесь равных объемов бромтимолблау и метилрота, фенолфталеин, метиленовый синий, раствор Люголя (1:2).
Питательные среды, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1 мл, стерильная водопроводная вода в пробирках по 9 мл и в колбах - по 50 мл. Чашки и пробирки с посевами. Микроскоп и все необходимое для микроскопирования.
ДРОЖЖЕВАНИЕ КОРМА
Дрожжи содержат много легкопереваримого белка, богаты эргостерином, легко переходящим в витамин D, витаминами А, В, Е; энергично размножаются, неприхотливы к среде обитания, их можно легко выращивать на отходах сельского хозяйства и промышленности. Кормовые дрожжи в настоящее время готовят в больших количествах, размножая их на производственных отходах, в том числе растительных гидролизатах (солома, древесные отходы и т. д.). Сейчас найдены дрожжи (Candida),хорошо размножающиеся на углеводородах. Это дает возможность готовить дешевые кормовые дрожжи на отходах нефтяной промышленности. Помимо добавления в кормовой рацион сухих дрожжей, применяют дрожжевание корма. Для этого в измельченную и увлажненную растительную массу вносят культуру дрожжей. Периодически перемешивают. Дрожжи обильно размножаются в корме, что обычно совпадает с его подкислением. Однако накопление кислот объяс-няется развитием молочнокислых бактерий, всегда обитающих на растительной массе. Для активного размножения дрожжей в кормах необходим ряд условий: хорошо подготовленная питательная среда (измельчен- ность, влажность, температура 25-27°С, достаточная аэрация, pH среды 3,8-4,2). Дрожжевать можно лишь корма, богатые моно- и дисахаридами. В противном случае дрожжи и молочнокислые бактерии развиваться не будут. Помимо концентратов, дрожжеванию подвергают сочные корма, к которым примешивают грубые корма.
При дрожжевании концентрированных кормов теряется 5-6% сухих веществ. Эти потери падают главным образом на углеводы, сбраживаемые дрожжами.
При дрожжевании кормов представляет интерес воз-можность обогащения корма белком за счет вносимого минерального азота. Дрожжи, потребляя соли аммония, обогащают субстрат белком на 13-17% (в расчете на сухое вещество). Дрожжевание делает корм приятнокислым, обогащает его витаминами, возбуждает у животных аппетит, устраняет многие заболевания (паратифозные инфекции, рахит молодняка, поражения кожи и другие болезни), благоприятно влияет на продукцию молока у коров, яйценоскость птицы, увеличение приве- са у животных. |
В лабораторной практике дрожжевание корма мож- * но провести на свекле, которую предварительно наре- зают мелкими кусочками, или на отрубях. Корм вносят в тарированный химический стакан емкостью 100 мл со стеклянной палочкой, увлажняют в случае отрубей до консистенции густой сметаны. Стаканы с кормом взвешивают. Масса увлажненного корма должна быть около 100 г. В качестве закваски используют однодневную разводку пекарских дрожжей на сусле в количест-¦ ве 5% (на 100 г корма вносят 5 мл суспензии дрожжей).
Корм тщательно перемешивают стеклянной палочкой, стакан накрывают бумажной этикеткой, на которой записывают тару стакана и массу увлажненного корма" (без закваски).
Дрожжеванные корма оставляют при комнатной тем-пературе, перемешивая содержимое стакана несколько раз в день.
Через 1-2 дня определяют количество дрожжевых ‘ клеток в корме.
Учет дрожжевых клеток в суспензии дрожжей (закваске)
" методом прямого их счета под микроскопом
Берут петлей определенное количество дрожжевой закваски (1 петля захватывает 0,01 мл), наносят на предметное стекло, добавляют столько же молока и размазывают на определенной площади (4 см2). Препарат сушат на воздухе, осторожно фиксируют на пламени и окрашивают метиленовым синим в течение 10 мин.
Под микроскопом с иммерсионной системой подсчитывают количество дрожжевых клеток (в 10 ПОЛЯХ
зрения). Количество дрожжевых клеток в 1 мл закваски определяют по формуле:
S
-А. 100,
Si
гдеА - среднее количество дрожжевых клеток в одном поле зрения;
S- площадь квадрата (4 с.м2);
Si- площадь поля зрения,
Si=jrr2,
где г - радиус объектива, определяемый с помощью объектного микрометра. На объектный микрометр наносят каплю кедрового масла н с иммерсионной системой определяют иа линейке объектного микрометра радиус объектива.
Если г объектива « 0,08 мм, то
S,=3,14.0,0064=0,02 мм2,
S 400 мм2
=20000.
Si 0,02 мм2
Учет дрожжевых клеток в дрсжжеванном корме
Через 1-2 дня стаканы с дрожжеванным кормом взвешивают. Вследствие сбраживания сахара и испарения воды масса корма становится меньше. Берут среднюю пробу в количестве 10 г, вносят в колбу, содержащую 100 мл стерильной водопроводной воды, и взбалтывают в течение 5 мин. Затем на определенной площади предметного стекла (4 см2) размазывают определенный объем суспензии (0,01" мл-1 петля) и добавляют 0,01 мл молока. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют осторожно на пламени, красят метиленовым синим в течение 10 мин. Подсчитывают количество дрожжевых клеток в одном поле зрения (10 полей зрения).
Среднее количество клеток в одном поле зрения умножают на 20 000, на 100 и 10, получают количество клеток в 1 г корма. Затем эту цифру умножают на массу корма и определяют число дрожжей во всем корме.
Чтобы узнать, во сколько раз увеличилось количество дрожжей в процессе дрожжевания корма, надо разделить их число на первоначальное количество дрожжевых клеток, содержащихся в закваске. Корм считается хорошим, если в одном поле зрения встречается не более 10 посторонних бактериальных клеток (не дрожжей).
Материалы и оборудование. Весы н разновесы, стаканы на 100 мл со стеклянными палочками, свекла, отруби, суспензия дрожжей, градуированные пипетки на 5-10 мл, петли, молоко в пробирках, предметные стекла с квадратом 4 см2 из миллиметровой бумаги, объектный микрометр, индикатор метиленовый синий, стаканы с дрожжеванным кормом. Микроскоп и все необходимое для микроско- пирования.

Занятие 4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОРМОВ

Цель занятия. Ознакомиться с методами санитарно-микробиологического анализа кормов.

Материалы и оборудование. Лабораторные весы; термостат; шуттель-аппарат; эксикатор; стерильные пробирки; пипетки; чашки Петри; фарфоровые ступки; ватно-марлевые фильтры; питательные среды (мясо-пептонные бульон, агар, желатин, лептонная вода, висмут-сульфит-агар, селенитовый бульон, магниевая среда, среды с мочевиной, глюкозой и сернокислым железом, углеводами и индикатором Андраде в сочетании с тимоловым синим, цитратноаммонийная среда, мясо-пептонный желатин, среды Вильсона- Блера, Киллиана, Китта-Тароцци, Кларка, Левина, Плоскирева, Ресселя, Эндо, Эйкмана, кровяной агар по Цейслеру, бульон Хот- тингера, молоко, печеночный бульон); физиологический раствор; индикаторные бумажки; лабораторные животные (белые мыши, морские свинки).

Общие сведения. От каждой партии корма отбирают две средние пробы массой не менее 500 г. Одну направляют в лабораторию, другую сохраняют в хозяйстве до окончания исследования. Для упаковки проб используют стерильную пластмассовую или стеклянную тару.

В пробах корма определяют общую микробную обсемененность, содержание сальмонелл, энтеропатогенных типов кишечной палочки, анаэробов.

Содержание занятия. Определение микробной обсемененности. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из средней пробы, добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1: 10). Из взвеси готовят последующие разведения (1: 100, 1: 1000, 1: 10 000 и т. д.). После осаждения взвешенных частиц для посевов берут жидкость из верхнего слоя.

Для количественного учета микробов в стерильные чашки Петри вносят по 1 мл из пробирок с разным разведением и доливают 10- 15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45 °С мясо-пептонного агара (МПА). Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37 "С на 24-48 ч. После этого подсчитывают выросшие колонии. Полученные результаты умножают на степень разведения, суммируют и определяют количество микробов в 1 г корма.

Пример расчета. В первой чашке обнаружено 200 колоний, во второй - 21, в третьей - 1. В эти чашки посевной материал брали из пробирок с разведениями соответственно 1: 10 000,1:100 000,1:1000 000. Следовательно, в 1 г корма будет содержаться

Микробную обремененность мясо-костной муки можно определить экспресс-методом с применением резазурина. Для этого в одну стерильную пробирку помещают 1 г средней пробы мясо-костной муки, добавляют 10 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) и встряхивают, а вдругую пробирку (для контроля) вносят только 10 мл МПБ. Пробирки помещают в термостат при 40 "С на 3 ч. После этого в них добавляют по 1 мл 0,01%-ного раствора резазурина и вновь выдерживают в термостате в течение 2 ч.

Результаты реакций учитывают через каждые 30 мин. По восстановлению резазурина (изменению окраски из синей в розовую) определяют общую микробную обсемененность мясо-костной муки. Если в пробирке с мясо-костной мукой розовое окрашивание наступает позднее чем через 2 ч, то это говорит о том, что в 1 г продукта содержится до 500 тыс. микробов, а при окрашивании в розовый цвет до 2ч - более 500 тыс. микробов.

Контролем служит пробирка с 10 мл МПБ и 1 мл 0,01 %-ного раствора резазурина, выдержанная в термостате при том же температурном режиме и экспозиции и без изменения цвета содержимого.

Исследование на сальмонелл ы. Для анализа берут 50- 200 г исследуемого корма, измельчают его в стерильной фарфоровой ступке и переносят в колбу со средой предварительного обогащения (пептонная вода, МПБ с содержанием 5 % маннита) при соотношении материала и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 16-18 ч материал высевают в чашки Петри на твердые дифференциально-диагностические среды (висмут-сульфит-агар, среда Плоскирева или Левина) и на две основные среды обогащения (селенитовый бульон, среда Киллиана в соотношении 1:1).

После 16-18 ч выдержки в термостате при 37 °С из сред обогащения делают вторично посевы в чашки с висмут-сульфит-агаром и в чашки со средами Плоскирева и Левина (по выбору) и ставят их в термостат при 37 °С.

Чашки просматривают через 16-24 и 48 ч.

На висмут-сульфит-агаре S. typhi и S.paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром, S. cholerae suis - в виде зеленых колоний. Колонии всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета, с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, участок среды под колонией черный. На среде Плоскирева вырастают прозрачные или нежно-розовые колонии, на среде Левина - прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые.

В случае обнаружения колоний, похожих на сальмонеллы, 3-5 из них высевают на комбинированную среду Ресселя или скошенный агар с мочевиной и бульон Хотгингера для определения индола и сероводорода (под пробирки с бульоном подкладывают специальные индикаторные бумажки). Для определения подвижности культуры делают посев уколом в полужидкий агар (0,3-0,5%-ный).

На среду Ресселя и скошенный агар посевы делают сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. Если разлагается мочевина в скошенном агаре, то окраска среды меняется на оранжевую при индикаторе BP и на коричнево-фиолетовую при индикаторе тимоловый синий в сочетании с индикато-ром Андраде.

Морфологию культуры изучают в мазках, окрашенных по Граму, и подвижность - в висячей или раздавленной капле или полужидком агаре. Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, исследуют серологически - испытывают в реакции агглютинации (РА) на предметном стекле с набором агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сыворотки (группы, А, В, С, D, Е).

Для РА с О-сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н-сыворотками - из нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны. По групповой О-сыворотке устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе.

Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки. 50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного физиологического раствора, встряхивают на шуггель-аппарате в течение 20 мин. Из полученной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1: 100, 1: 1000, 1: 10 000, 1: 100 000, 1: 1 000 000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки со средой Эйкмана. Посевы помешают в термостат при температуре 43 °С. Через 24 ч учитывают рост по помутнению среды и образованию газа. Титр кишечной палочки устанавливают по наи-большему разведению, в котором еще наблюдался ее рост.

Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциальные среды (Эндо, Левина, Плоскирева), разделенные на секторы для каждого разведения.

Типичные колонии Е. coli круглой формы, гладкие, выпуклые или слегка приподнятые в центре с ровными краями розового, красного или малинового цвета, с металлическим блеском или без него на среде Эндо или черного цвета на среде Левина.

Выросшие изолированные колонии S-формы (не менее 4) пересевают на МПБ, выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 16-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посевов на дифференциальные диагностические среды, заражения мышей; вторую - для приготовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не будет агглютинироваться поливалентными (комплексными) коли-сыворотками.

У выделенных культур определяют морфологические и культу-рально-биохимические свойства для установления их родовой принадлежности. Морфологию бактерий изучают в мазках, окрашенных по Граму, их подвижность определяют по характеру роста в 0,3%-ном полужидком МПА.

Для определения культурально-биохимических свойств бактерий используют набор питательных сред (с углеводами и индикатором Андраде, цитратно-аммонийную, мясо-пептонный желатин, МПБ или бульон Хоттингера и агар с глюкозой и сернокислым железом).

Патогенные свойства кишечной палочки определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. Для этого трем мышам массой 14-16 г внутрибрюшинно вводят смывы с суточных агаровых культур в дозе 500 млн микробов. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые 4 сут после заражения.

Исследования на анаэ р об ы. 50 г корма растирают в стерильной ступке, разводят физиологическим раствором и засевают в несколько пробирок со средой Китга-Тароцци, Вильсона-Блера, молоком и в две чашки со средами и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничтожения вегетативных форм микробов по одной пробирке с жидкими средами нагревают при температуре 80 °С в течение 20 мин. Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной погло-титель кислорода.

Результаты посевов регистрируют в тот же день. Почернение среды Вильсона-Блера в течение 1 -3 ч после посева, свертывание молока с образованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 ч, а также быстрое начало роста на среде Китта-Тароцци (через 4-5 ч) при обильном газообразовании - характерные признаки присутствия возбудителей Cl. perfringens.

Рост CI. botulinum, наблюдаемый обычно на 2-3 сут, характеризуется помутнением среды Китта-Тароцци, образованием осадка и появлением запаха прогорклого масла.

При обнаружении роста на среде Китта-Тароцци проводят микроскопическое исследование и выделение чистой культуры посевом в 2-3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру. Последние выдерживают в анаэробных условиях при температуре 37 °С в течение 24- 48 ч, после чего просматривают рост в чашках и отбирают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам.

Биологическую пробу ставят на морских свинках или белых мышах, вводя внутрибрюшинно бульонную культуру. При положительном результате подопытные животные погибают через 12-48 ч.

Для идентификации отдельных возбудителей или типов одного вида проводят опыт нейтрализации токсина со специальной сывороткой. Для этого минимальную смертельную дозу культуры в смеси с 0,2-0,5 мл соответствующей типоспецифической сыворотки выдер-живают в термостате 45 мин и вводят мышам внутрибрюшинно. Для контроля испытуемую культуру или фильтрат применяют без сыворотки. Вид и тип микроба определяют по выживаемости мышей.

При исследовании кормов на ботулизм (наличие токсинов) в качестве подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены два способа:

а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой (антитоксином). Корм предварительно растирают в стерильной ступке, добавляют физиологический раствор (1: 4) и настаивают в течение 1 -2 ч при комнатной температуре. После этого настой центрифугируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. КО,5 мл фильтрата добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки. Смесь выдерживают 1 ч при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно 0,5 мл фильтрата, другому - смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе.

Аналогичные испытания могут быть проведены чистой культурой, выращенной (в течение 6-7сут) на печеночном бульоне. В этом случае пастеровской пипеткой отсасывают верхний слой культуры и пропускают через ватно-марлевый фильтр. Далее поступают, как указано выше;

б) разрушение токсина кипячением фильтрата. Фильтрат готовят, как указано в подпункте «а». Одну половину фильтрата кипятят в течение 30 мин. Затем одному животному внутрибрюшинно вводят 0,5-1 мл некипяченого фильтрата, другому - такую же дозу кипяченого.

Положительным результатом биологической пробы по первому и второму способам считают гибель мышей, наступившую как от фильтрата, не обработанного противоботулиновой сывороткой, так и от некипяченого фильтрата.